Ratchanok Sirikharin1,2,3,Suparat Taengchaiyaphum1,Kallaya Sritunyalucksana1、2，Siripong Thitamadee1、3，蒂莫西·w·弗莱格尔(Timothy W. Flegel)1、5，Rapeepat Mavichak6和Porranee Proespraiwong6
1.泰国曼谷拉玛维路，玛希多大学理学院，Centex虾仁
2.泰国曼谷拉玛六路国家科学技术发展署国家遗传工程和生物技术中心虾病毒相互作用实验室(ASVI)
3.泰国曼谷拉玛维路玛希多大学理学院生物技术系
5.国家科学技术发展署国家遗传工程和生物技术中心(BIOTEC)，巴吞他尼，12120，泰国
6.泰国Samutsakorn 74000, Charoen Pokphand Co. Ltd.， 82/2 M. 4, Rama 2 Rd.， Km 41.5, T. Bangtorat, A. Muang Samutsakorn, Samutsakorn 74000，水产动物健康研究中心
背景
本文介绍了一种检测分离菌的新方法弧菌parahaemolyticus可引起急性肝胰腺坏死病(AHPND)。这种方法是基于一个蛋白质的基因序列发现的亚部分无细胞培养肉汤分离物诉parhaemolyticus导致AHPND，但不是来自诉parahaemolyticus或者其他不会引起AHPND的细菌。这种无细胞制剂在反向灌胃给虾时引起急性AHPND(肝胰腺小管上皮细胞大量脱落)的典型症状。它含有58和12 kDa两个显著的蛋白条带。分别从这些蛋白中提取的肽片段进行质谱分析后，经吉祥物分析，发现其与细菌毒素对昆虫有显著的同源性。引物被设计用来扩增来自AHPND细菌的这些蛋白质的完整基因序列。测序得到的扩增子后,设计的引物PCR方法检测这些蛋白基因,并初步测试几隔离AHPND和non-AHPND细菌隔离透露,这两种方法都给了积极的结果为所有AHPND隔离,但仅58 kDa蛋白质还提供了一些积极的结果non-AHPND隔离。因此，我们使用PCR方法对12 kDa蛋白进行了进一步的检测。本研究共分离出98株细菌，包括经生物测定证实的非AHPND(35)和AHPND(49)副溶血性弧菌(共84株)，以及在虾池中常见的14株细菌，包括其他种类的弧菌和光杆菌。49株AHPND分离株检测结果均为阳性，其余均为阴性。这使得新方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值均为100%，而之前推荐的AP2 PCR方法的敏感性为100%，特异性为97.7%，阳性预测值为97.4%，阴性预测值为100%。 The isolate that gave a false positive test result in the test with the AP2 method was included in the test of the new method and it gave a correct, negative test result.
从这些结果，我们建议我们先前宣布的AP1和AP2引方法与此，为了方便，我们想调用AP3引物法新方法所取代。我们也想建议谨慎调用12 kDa蛋白毒素，因为它的异源表达形式的毒性试验尚未完成。也没有被与58 kDa蛋白来完成。尽管这两种蛋白给从AHPND细菌生物活性培养液中部分优势带，即使他们有相似先前报道的昆虫毒素，他们可能会或可能不会是负责大量的细胞脱落AHPND的特征。尽管不确定性，AP3方法的效用已被证明优于该AP2和以前一样，我们希望可以自由地分散检测AHPND细菌的工具，并在努力控制蔓延尽快应用这种新的疾病。
AP3引物靶、引物及PCR方案的序列如下，可用于AHPND细菌的检测。对于那些之前已经确认的人诉parahaemolyticus分离，让与AP2方法阳性PCR检测结果，但尚未进行虾的生物测定，我们推荐AP3方法中的额外的测试才这样做的。正如前面推荐的方法AP2，我们不建议使用这种方法来巢式PCR的适应。1步PCR法是足够灵敏以从细菌分离株的DNA提取物。然而，从虾组织，如HP和胃，从亲鱼或幼虾的粪便，从整个后期幼体和其他可疑的运营商，并从环境来源如池塘底质样品，我们建议在TSB含1.5％NaCl的初步富集步骤补充温育4小时，在约30℃下振荡。在此之后，让任何碎屑沉降，然后除去上清液混浊，离心以沉淀细菌，弃去上清液溶液。从细菌沉淀和使用约100ng模板用于每个PCR测试的提取物的DNA。
该PCR方法的详细信息
PCR引物
AP3 |
5 ' 3 ' |
长度 |
％GC |
Tm |
助教 |
预期扩增子 |
F |
ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC |
26 |
23.08 |
57.63 |
53 |
336个基点 |
R |
GTGGTAATAGATTGTACAGAA |
21 |
33.33 |
55.46 |
PCR反应条件
组件 |
µl |
协议 |
|||
10 x PCR混合 |
2.5 |
变性 |
94℃，5分钟 |
||
50 mM MgCl2 |
0.7 |
30个周期 |
|||
变性 |
94℃，30秒 |
||||
10毫米核苷酸 |
0.4 |
退火 |
53℃，30秒 |
||
10µM CN2-F1 |
0.5 |
延期 |
72℃，40秒 |
||
10µM CN2-R1 |
0.5 |
最后 |
72°C, 5分钟 |
||
Taq DNA波尔 |
0.2 |
||||
总 |
25.0 |
||||
AP3靶序列336 bp
ATGAGTAACAATATAAAACATGAAACTGACTATTCTCACGATTGGACTGTCGAACCAAACGGAG
GCGTCACAGAAGTAGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGAAGTCGGTCGTAGTGTAGACAT
TGAGAATACGGGACGTGGGGAGCTTACCATTCAATACCAATGGGGTGCGCCATTTATGGCTGGC
GGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATGTGGTACAACGTGATGAAACTTACCATTTACAACGCCCTG
ATAATGCATTCTATCATCAGCGTATTGTTGTAATTAACAATGGCGCTAGTCGTGGTTTCTGTAC
AATCTATTACCAC
确认
这种PCR法和底层蛋白质组学工作是由泰国的科学家合作，在泰国虾Centex公司和水生动物健康研究中心开发研制。它也完全由来自泰国的科研经费支持。在2013年初然而，它也使用的信息和材料之前获得长：工作发生陈德良，努南，雷德曼，Mohney，潘托哈，菲茨西蒙斯和莱特纳（45-55派息Aquat组织105）的开创性公布之后。因此，我们要感谢我们的AHPND研究从农业研究和发展机构的支持和鼓励，泰国国家研究理事会，泰国委员会高等教育，玛希隆大学，国家科技发展局，北大年虾农俱乐部，Surathani虾农俱乐部，泰国冷冻食品协会，正大公司，SyAqua有限公司和泰盟有限公司